МИКРОМЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЙОДА В МОЧЕ
М.И. Арбузова1, А.А. Махмудов2, Г.А. Герасимов3, А.В. Ильин1

1 ФГУ Эндокринологический научный центр Росмедтехнологий МЗ и CP РФ
2 Центр по контролю за профилактикой и заболеваемостью (США)
3 Международный совет по контролю за йоддефицитными заболеваниями

Концентрация йода в моче — прямой количественный показатель текущего потребления йода в популяции. Наиболее распро-страненным методом определения йода в моче является церий-арсенитный метод с предварительной обработкой образцов рас­твором персульфата аммония.

 Цель исследования. Разработка модификации данного метода для уменьшения образования токсичных продуктов реакции.

Описанный метод имеет хорошие характеристики (чувствительность метода — 11 мкг/л, CV < 10%, коэффициент корреляции с референсным методом составляет 0,99); количество образующихся в процессе реакции токсичных веществ уменьшается в 3 раза, себестоимость исследования снижается вследствие уменьшения расхода реактивов и деионизированной воды.

Iodine concentration in urine is the direct quantity indicator of the current consumption of iodine in the population. The most widespread method of determination of iodine in urine is cerium-arsenic method with preliminary processing sam­ples of urine using the solution ammonium persulfate. The purpose of work was to develop updating of the given method for reduction of the formation of toxic products of the reaction. Described method has good characteristics (the limit of the detection of this method 11 ug/1, CV < 10 %, the coefficient of the correlation with reference method 0.99), the amount of toxic substances formed during reaction decreases in 3 times, the cost price of research is reduced owing to reduction of the volume of reagents and water.

Введение
Содержание йода в моче является прямым количест­венным показателем текущего потребления йода на­селением и хорошим биохимическим маркером рас­пространенности йододефицитных заболеваний в отдельно взятом регионе. Рекомендуемый между­народными организациями по контролю за йод оде-фицитными заболеваниями персульфатный способ обработки образцов мочи при определении йода це-рий-арсен?тным методом [2, 4], обладая несомнен­ными преимуществами перед перхлоратным спосо­бом, имеет вместе с тем ряд недостатков. В частнос­ти, метод требует большого расхода реактивов, что сопровождается образованием значительного коли­чества токсичных продуктов реакции. В последнее время появился ряд микрометодов, например мик­ропланшетный метод Ohashi et al. [3], который позво­ляет значительно уменьшить образование токсич­ных продуктов и хорошо коррелирует с методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плаз­мой (ICP-MS), являющимся в настоящее время для определения йодурии референсным [1]. К сожале­нию, стоимость этих наборов достаточно велика, и доступность их для нашей страны осложняется к тому же таможенными требованиями.

В России компания "БиохимМак" предлагает набор оборудования для собственной модификации метода определения йодурии. Однако корреляция его с общепринятым методом [2] недостаточна для получения точных результатов (р = 0,75; п = 104 против необходимого р > 0,95). Целью нашей рабо­ты было создать модификацию персульфатного спо­соба определения йода в моче, позволяющую не только уменьшить расход реактивов, но и быть адек­ватной предъявляемым к подобным методам требо­ваниям [2].

Материал и методы
Средства измерений и вспомогательные устройства

• Проточный фотометр или спектрофотометр для измерения оптической плотности при длине волны 405 Нм с погрешностью определения не более ±1%.
• Алюминиевый термоблок для пробирок ("Термо-48", "Биоком"), обеспечивающий темпера­туру нагрева 100—120 °С, с погрешностью ±1 °С*
• Весы аналитические, 2-й класс точности по ГОСТ 21104.*
• Миксер (вортекс).
• Колбы мерные, наливные, 2-й класса точнос­ти, объем - 500 и 1000 мл по ГОСТ 17170.
• Микропробирки полипропиленовые, объем 1,5 мл, с крышками на замках (фирма "Эппендорф", Германия), соответствующие ячейкам термоблока.
• Автоматические пипетки на 50—200, 100-1000 мкл по ГОСТ 17170.*
• Эрленмейеровские колбы (125 и 500 мл).
• Наконечники - 10-100 мкл.
• Наконечники - 100-1000 мкл.
• Реактивы
• Исходные реактивы [2] должны быть свободны от йода. В работе использовались реактивы и деиони-зированная вода 1-го класса фирмы Fluka (Швейца¬рия). При допустимом следовом содержании йода в реактивах данного метода значение оптической плотности калибровочной пробы с нулевым стан¬дартом при комнатной температуре 25 °С и времени церий-арсенитной реакции 30 мин было 2,0 ± 0,1 D.
• Реактивы для определения общего йода данным методом представляют собой предварительно приго¬товленные растворы. Необходимые растворы гото¬вили согласно рекомендациям [2]. Соотношение ко¬нечной концентрации мышьяка и церия в реакцион-ной среде составляло 9 : 1 (табл. 1).

Таблица 1. Конечная концентрация компонентов, входящих в состав реакционной среды.

Образцы мочи
Для определения концентрации общего йода ис­пользуют только утреннюю или дневную порцию мочи. Сбор образцов производят в пластмассовые стаканы. Затем пробы переносят в пробирки, кото­рые плотно закрывают и номеруют. Образцы можно хранить при t = 4—8 °С не более 5 сут или в заморо­женном виде не более 3 мес.

При поступлении образцов в лабораторию про­водится их сортировка. Обычно составляются пар­тии, которые удобны для определения (количество образцов в партии зависит от интервала добавления в пробы раствора церия сульфата). В нашем случае партия обычно состояла из 90 реакционных проби­рок (12 стандартных растворов, 6 контрольных об­разцов и 72 образца мочи) и при 30-секундном ин­тервале требовала 4 ч работы. Вторая, такая же пар­тия добавляет еще 1 ч, то есть опытный исследова­тель может в неделю выполнять до 700 анализов.

Контрольные образцы мочи
Представляли собой сливные образцы мочи, в кото­рых проведено определение концентрации йода не менее 5—10 раз в серию и не менее чем в 10 сериях для вычисления средней величины, внутрисерийного и межсерийного CV. Использовались контроль­ные образцы с 3 концентрациями йода (низкая, средняя и высокая). Стандартный референсный ма­териал SRM® 2670а был получен из Центра по контролю за профилактикой и заболеваемостью (США).
Метод измерения
Определение общего йода в моче выполняется путем' фотометрии реакционной среды за фиксированный 2 интервал времени.
Принцип метода
Определение микроколичеств йода (в виде йодйд-. йона) основано на его каталитическом действии на процесс восстановления церия (IV) мышьяком (III). (реакция Санделла—Кольтхоффа) [5]. Скорость уменьшения интенсивности окраски раствора церия (IV) зависит от содержания йода и измеряется фото" метрически при длине волны 405 Нм.
Ход определения
Определение концентрации общего йода в моче вы­полняют в 2 этапа. Все процедуры проводятся в вы­тяжном шкафу.
1-й этап: подготовка проб. Подготовка проб заключается в последовательной обработке образцов окислительной смесью (раствор персульфата аммо ния) при повышенной температуре с распадом всех органических компонентов мочи до неорганическо­го состояния с высвобождением связанного йода и переходом его в йодид-йон. Калибровочные рас­творы йода, контрольные и исследуемые образцы необходимо довести до комнатной температуры и перемешать. В пронумерованные полипропилено­вые микропробирки с крышками на замках внести калибровочные, опытные и контрольные образцы (по 0,1 мл) и раствор для обработки проб (0,2 мл). Пробирки закрыть пробками и поместить в термо­блок, предварительно нагретый до 100 °С. Время об­работки проб составляет 60 мин. По окончании ин­кубации пробирки открыть, поместить в штатив и оставить в вытяжном шкафу при комнатной темпе­ратуре на 10—15 мин. Пробирки с закрытыми проб­ками могут храниться в течение суток до начала оп­ределения.
2-й этап: измерение концентрации йода. Подгото­вить к работе проточный фотометр (прогреть, уста­новить длину волны 405 Нм). Во все пробирки внести арсенидный раствор (по 0,9 мл), перемешать и инкубировать при комнатной температуре 15 мин. Затем, в каждую пробирку поочередно с интервалом  в 30с, внести раствора церия сульфата (по 0,06 мл) и тщательно перемешать. Строго через 30 мин после внесения раствора церия сульфата в первую калиб­ровочную пробу измерить оптическую плотность об­разцов при 405Нм с интервалом в 30 с. Температур­ный режим в период проведения церий-арсенитной реакции и фотометрии должен быть стабильным.

Обработка результатов измерения
Обработку результатов измерения выполняли с по­мощью градировочного графика. Для этого вычис­ляли десятичный логарифм оптических плотностей калибровочных растворов и опытных образцов. Гра-дуировочный график представляет собой зависи­мость десятичного логарифма абсорбции калибро­вочных растворов (ось ординат) от концентрации в них йода (ось абсцисс). Зависимость- должна но­сить линейный характер, то есть представлять собой прямую линию. Для каждой неизвестной пробы кон­центрация йода вычислялась по логарифму соответ­ствующей абсорбции. Если логарифм абсорбции пробы оказывался ниже, чем в стандартной кривой, этот образец был разведен деионизированной водой и определен повторно. Результаты определения счи­таются правильными если:

1. градуировочный график представляет собой прямую линию. (Если линейность не получается, ис­следование необходимо повторить с тщательной проверкой каждого этапа определения.);
2. значения контрольных проб отличаются не более чем на 10% от их средних значений.

Определение йода в моче методом ICP-MS вы­полнено в Центре по контролю за профилактикой и заболеваемостью (США). Обработка данных про­водилась при помощи программы Microsoft Excel. Рассчитывались коэффициенты и вариации, и ли­нейной корреляции.

Результаты и их обсуждение
Чувствительность микрометода составляет 11мкг/л (8-14мкг/л; n =8; 5серий). Для определе­ния коэффициентов вариации (CV) в серии и изо дня в день использовали сливные образцы мочи с низким, средним и высоким содержанием йода. Для вычисления серийного CV определение йода проводилось в 8 репликах каждого образца мочи. Для вычисления межсерийного CV использовали ре­зультаты определения йода в дубликатах этих образ­цов мочи в течение 20 различных дней. Коэффици­ент вариации (CV) не превышал 5% (табл.2).

Таблица 2. Точность метода.

  Открываемость добавленного йода оценивали, анализируя те же сливные образцы мочи в триплетах с добавлением в них1 объема деионизированной во­ды или раствора йодата калия ( 1000 мкг/л) в 9 объе­мах мочи. Открываемость добавленного йода соста­вила 98-110% (табл.3)

Таблица 3. Открытие добавленного йода (п = 3)

Влияние интерферирующих веществ на опреде­ление йода в моче оценивали в триплетах образцов мочи с добавлением разных концентраций веществ, которые могут содержаться в моче. Глюкоза, аскорбиновая кислота и FeNH4 (S04), в диапазоне концен­траций 0—20 ммоль/л не оказывали влияния на ре­зультаты исследования (табл. 4).

Таблица 4. Влияние глюкозы, L-аскорбиновой кислоты и FeNH4 (S04)2 на измерение йода в моче (п = 3)

При сравнении результатов, полученных дан­ным микрометодом и общепринятым методом [2], коэффициент корреляции составил 0,98 (п = 136). Анализ данных, полученных микрометодом и ICP-MS, в диапазоне концентраций йода от 20 мкг/л до 300 мкг/л выявил линейную зависимость; коэффи­циент корреляции 0,99 (п = 32).
Таким образом, предлагаемый метод имеет хо­рошую чувствительность (11 мкг/л), точность в пре­делах 0-300 мкг/л (CV < 5%), хорошо коррелирует с референсным и общепринятым методами, что поз­воляет использовать его для определения потребле­ния йода в популяции [2, 4]. Следует отметить, что при этом в 3—4 раза уменьшается расход реактивов и количество токсичных продуктов реакции, а ис­пользование одноразовых реакционных пробирок исключает этап их мытья, требующего большого объема деионизированной воды.

Выводы
1. Предлагаемый микрометод определения йода в моче обладает достаточной чувствительностью и оценки потребления йода в популяции.

1. Метод позволяет уменьшить количество рас­ходуемых реактивов и токсичных продуктов реакции в 3 раза.
2. Данный метод позволяет исключить этап мы­тья реакционных пробирок и уменьшить расход деи­онизированной воды.

Список литературы

1. Caldwell K.L., Maxwell СВ., Makhmudov A. et al. Use of induc­tively coupled plasma mass spectrometry to measure urinary iodine in NHANES 2000: comprasion with previous methods // Clin. Chem. 2000. V. 49. P. 1019-1021.
2. Laboratory Guide to the Measurement of Iodine in Urine and Salt. Atlanta (USA), 2003.
3. Ohashi Т., Yamaki V., Pandav C.S. ei al. Simple microplate method for determination of urine iodine // Clin. Chem. 2000. V. 46. P. 529-536.
4. Pino S., Fang S.-L., Braverman I.E. Ammonium persulfate: a safe alternative oxidizing reagent for measuring urinare iodine // CUn. Chem. 1996. V. 42. P. 239-243.
5. Sandell E.B., Kolthoff I.M. Micro determination of iodide by a cat­alytic method // Microchim. Acta. 1937. V. 1. P. 9-25.